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Akustische Mikroskopie mit Phasenkontrast

Einleitung | Verfahren | Anwendungsbeispiele | Referenzen

Einleitung

Die akustische Mikroskopie, die seit etwa 20 Jahren in der Form der konfokalen Rastermikroskopie (Scanning Acoustic Microscopy, SAM) verfügbar ist [1], nutzt zur Abbildung longitudinal polarisierte Ultraschallwellen (Kompressionswellen), die den mechanischen Wellen zuzuordnen sind. Der Kontrast beruht deshalb unmittelbar auf den mechanischen respektive den elastischen Eigenschaften der untersuchten Proben. Dazu gehören die Dichte, die Kompressibilität, die Geschwindigkeit der Schallwellen und deren Dämpfung sowie die akustische Impedanz.

Bei der Werkstoff- und Materialcharakterisierung sowie bei Anwendungen in der Biologie (zu Einführung und Übersicht siehe [2]) im Bereich der hochauflösenden Ultraschallmikroskopie, die auch die Untersuchung lebender Zellen einschließt, werden Ultraschallfrequenzen im Bereich von 1 bis 2 GHz genutzt. Bei 2 GHz ist mit kommerziell erhältlichen Ultraschallobjektiven eine laterale Auflösung von bis zu 0,6µm erreichbar.

Für Anwendungen in der Biologie und bei der Materialcharakterisierung wurde von uns ein Ultraschallmikroskop mit Phasenkontrast (Phase-sensitive Scanning Acoustic Microscope, PSAM) entwickelt [3]. Bezüglich des Einsatzes bei der Reflexionsmikroskopie ähnelt das Gerät den auch kommerziell erhältlichen Ultraschallrastermikroskopen, mißt jedoch neben der Amplitude zusätzlich die Phase der Ultraschallsignale. Damit steht die gesamte in den Ultraschallsignalen enthaltene Information zur Nutzung bei der Abbildung zur Verfügung.

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Verfahren

Das entwickelte Raster-Ultraschallmikroskop mit Phasenkontrast, das für Schallfrequenzen von 70 MHz bis 1,6 GHz ausgelegt ist, nutzt zur Abbildung kommerziell erhältliche fokussierende Ultraschalltransducer (Ultraschallobjektive). Die Phasenlagen der Ultraschallsignale werden relativ zu dem bei der Anregung genutzten hochstabilen Hochfrequenzoszillator bestimmt. Zur Erzeugung eines Bildes in Reflexion wird mit einer mechanischen Rastereinheit die Position des Ultraschallobjektives relativ zur Probe verändert. Da der für jeden Phasenkontrast typische Referenzzweig rein elektronisch ausgeführt ist, wird die Rasterebene zu einer Bezugsebene bezüglich der Phasendetektion. Zur Bildaufnahme und Steuerung dient ein Rechner mit zweikanaliger Bildverarbeitung, der in Echtzeit jeweils ein Bild in Amplituden- und Phasenkontrast auf einem Monitor darstellt und gegebenenfalls die Daten speichert und weiterverarbeitet.

Bei der ebenfalls entwickelten ultraschallmikroskopischen Holographie ist ein sendendes Objektiv bezüglich der zu untersuchenden Probe fest montiert, wobei sich der Fokus auf der Probenoberfläche befindet. Ein gerastert bewegtes Empfangsobjektiv wird auf die gegenüberliegende Probenoberfläche fokussiert. Damit werden die vom Ort der Anregung im Objekt ausgehenden Schallwellen an der gegenüberliegenden Oberfläche nach Phase und Amplitude ortsaufgelöst erfaßt. Ohne Objekt würde so das Hologramm einer sich in der Koppelflüssigkeit ausbreitenden Kugelwelle ermittelt werden.

Zudem wurde ein als Durchstrahlungsmikroskopie bezeichnetes Verfahren (Abbildung 1) entwickelt, bei dem ein Ultraschallobjektiv mit dem Fokus auf die Vorderfläche der Probe justiert wird. Ein zweites als Detektor eingesetztes entsprechendes Objektiv wird mit dem Fokus auf den gegenüberliegenden Punkt der rückwärtigen Fläche der Probe justiert. Die Probe wird parallel zur Vorder- beziehungsweise Rückfläche gerastert. Aufgenommen wird die Amplitude und Phase des transmittierten Ultraschallsignals.

ReflexionsmikroskopieHolographieDurchstrahlungsmikroskopie
Abbildung 1: Anordnung der Ultraschallobjektive und der Probe bei den unterschiedlichen eingesetzten ortsauflösenden Verfahren.
 

  Die Schallausbreitung in der Probe zwischen dem Fokus des sendenden und des empfangenden Ultraschallobjektivs bestimmt die Abbildung. Die durch Rasterung der Probe erzeugten akustischen Bilder würden im eher gewohnten optischen Fall der Durchleuchtung mit parallelem Licht entsprechen. Durch zeitliche Selektion (Gate) wird bei gepulster Schallanregung nur das direkte Signal nach Amplitude und Phase erfaßt und damit in inhomogenen Proben der kürzeste mögliche Schallweg selektiert. Dadurch können an stark streuenden Proben die durch die Streuung verursachten Signalbeiträge unterdrückt werden.

 

  Bei den eingesetzten Verfahren liegt die der erreichbaren Phasenauflösung entsprechende Laufzeitauflösung für gut reflektierende oder transmittierende Proben und 5 ms Mittelungszeit bei 100 fs (Abbildung 2). Die Dynamik des linearen Bereichs bei der Amplitudendetektion beträgt bei fest eingestellter Verstärkung bis zu 76 dB. Bei Bildgrößen bis zu 4 mm ´ 4 mm und 500 ´ 500 Bildpunkten (Pixeln) dauert der Bildaufbau (Rasterung) typisch 10 bis 20 s.

Abbildung 2: Aus dem Phasenkontrast resultierende Laufzeitauflösung für einen Teil einer Bildzeile. 100 fs Zeitauflösung entsprechen im Koppelmedium Wasser 0,075 nm Abstandsauflösung bei Beobachtung in Reflexion.

   Im Falle der Reflexionsmikroskopie entspricht das Verfahren weitgehend der konfokalen Laser-Rastermikroskopie mit Phasenkontrast, gestattet aber wegen der gepulsten Anregung und der gegenüber der Lichtgeschwindigkeit erheblich langsameren Schallgeschwindigkeit (1,5 km/s in Wasser) eine zeitselektive Erfassung der aus dem Fokalbereich reflektierten Ultraschallsignale.

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Anwendungsbeispiele

Als Beispiel für ein Objekt, bei dem der Kontrast wegen des hohen Reflexionsgrades fast ausschließlich durch die Eigenschaften des Objektes unmittelbar an der Oberfläche bestimmt wird, werden die Ultraschallbilder eines integrierten Schaltkreises auf einem Siliziumeinkristall vorgestellt (Abbildung 3).

AmplitudenkontrastPseudo-dreidimensionale Darstellung
Abbildung 3:  Ultraschallbilder eines integrierten elektronischen Schaltkreises mit Leiterbahnen (im Amplitudenkontrast mittelgrau) und Ätzstufen. Die pseudo-dreidimensionale Darstellung wurde aus dem hier nicht dargestellten Phasenkontrastbild (siehe [3]) errechnet, das eine Höhenauflösung von etwa 2 nm erreicht. Diese Auflösung kann von der Graphik nicht voll wiedergegeben werden. Im Amplitudenkontrast ist die Helligkeit proportional zur Amplitude des reflektierten Ultraschalls. Die Ultraschallbilder wurden bei 1,2 GHz mit Wasser als Koppelmedium aufgenommen.
  

 Bei der Abbildung von dünnen Zellen, die auf einem Objektträger aufgewachsen sind, stammt der wesentliche Signalbeitrag aus dem Anteil der Schallwellen, der am Objektträger unter der Zelle reflektiert wird. Der Kontrast wird für jeden Bildpunkt zum größten Teil von den Materialeigenschaften im Innern der Zelle in Laufrichtung des Ultraschallsignals bestimmt. Er wird nur in geringem Maße von den an der Zelloberfläche reflektierten Schallwellen beeinflußt. In Abbildung 4 ist eine Zelle in Amplituden und Phasenkontrast dargestellt.

AmplitudenkontrastPhasenkontrast
Abbildung 4:  Abbildung einer fixierten XTH2-Zelle. Die Grauskala im Phasenkontrast-Ultraschallbild ist proportional zur Phasenvariation und mit Ausnahme der Auflösung (Rauschen) nicht von den Amplituden beeinflußt (Vektorkontrast). Die Breite der Bilder beträgt etwa 100 µm. Die Ultraschallbilder wurden bei 1 GHz mit Wasser als Koppelmedium aufgenommen. Die maximale Dicke der Zelle im Mittelbereich beträgt knapp 2 µm.
Abbildung 5: Pseudo-dreidimensionale Darstellung des Phasenkontrastbildes aus Abb. 2.
 

  Der Phasenkontrast im dünnen Außenbereich ist weitgehend proportional zu der gegenüber der umgebenden Flüssigkeit veränderten Schallaufzeit in der Zelle. Der Amplitudenkontrast wird überwiegend durch die Schallabsorption in der Zelle bestimmt. Im dickeren Bereich des Zellkernes (Abb. 4 und 5 Bildmitte) beeinflussen Interferenzen den Kontrast merklich. Sie können zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften (Dichte, Schallgeschwindigkeit, Dämpfung) der Zelle genutzt werden. Für homogene Materialien wurde dazu ein einsatzfähiges Verfahren entwickelt [4]. Die im Falle der inhomogenen Zellen noch erforderlichen weiteren Daten versuchen wir derzeit aus der Frequenzabhängigkeit der Amplituden und Phasen sowie mit dem im Gerät integrierten Kraftmikroskop [3] zu gewinnen.

 

  Für größere biologische Objekte wurde ein 3-dimensionales Rasterverfahren bei der konfokalen Mikroskopie in Reflexion entwickelt. Dies erlaubt sowohl die Beobachtung der Eigenschaften des Objektes an der im Abstand variablen Oberfläche als auch im Innern der Probe (Abbildung 6).

Abbildung 6:  Dreidimensionale Ultraschallaufnahme eines Auschnitts aus dem Flügel einer Zikade im Amplitudenkontrast. Auf den Seiten ist das Tiefenprofil für die Amplitude der Schallsignale dargestellt. Bei der gewählten höhenverschobenen Darstellung liegen die hell zeichnenden Strukturen im Bereich der dargestellten Oberfläche. Ultraschallfrequenz 1,2 GHz; Koppelmedium Wasser.

   Das elastische Verhalten von Objekten kann auch mit Hilfe von Ultraschallhologrammen charakterisiert werden (Abb. 7). Dieses ursprünglich für die Bestimmung der Elastischen Konstanten von Einkristallen entwickelte Verfahren [5] wurde in Kooperation mit U. Cobet und H. Hartmann, Institut für Medizinische Physik und Biophysik der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg auch zur Charakterisierung von Knochen eingesetzt (Abb. 8).

Abbildung 7:  Akustisches Phasenhologramm einer Glasplatte (links, isotropes Material) und einer Siliziumeinkristall-Scheibe (rechts, anisotropes Material).
AmplitudenkontrastPhasenkontrast
Abbildung 8:  Amplituden und Phasen eines Ultraschallhologramms einer scheibenförmigen Knochenprobe, aufgenommen bei einer Ultraschallfrequenz von 89 MHz für longitudinale Polarisation. Die Bildbreite beträgt 1,3 mm. Die Anregung erfolgt auf der Rückfläche der Probe in Bildmitte, die Detektion auf der Vorderfläche. Die aus dem Bild in Phasenkontrast bestimmte mittlere Schallgeschwindigkeit ergibt sich zu etwa 3,1 km/s.

   Zur ortsaufgelösten Untersuchung der mechanischen Eigenschaften im Inneren von Werkstoffen kann zudem die Durchstrahlungsmikroskopie mit Phasenkontrast eingesetzt werden. Am Beispiel eines 50-Pfennigstücks wird erkennbar (Abbildung 9), daß der gesamte, näherungsweise linienförmig durchstrahlte Bereich der Probe zwischen den Fokalpunkten zum Kontrast beiträgt. Die unterschiedlichen Amplituden und Phasen werden bei diesem ersten Beispiel allerdings durch die Oberflächenbeschaffenheit der Probe verursacht. So sind im Amplitudenkontrast neben der "50" oben im Bild auch Nase und Mund sowie links Hände und Arme der Dame von der anderen Seite der Münze erkennbar. Im Phasenkontrast werden die unterschiedlichen Laufzeiten durch die Probe zusammen mit den hier ebenfalls ortsabhängig veränderlichen Lauflängen in Wasser deutlich.

AmplitudenkontrastPhasenkontrast
Abbildung 9:  Ultraschall-Durchstrahlungsbilder eines Ausschnitts aus einem 50-Pfennigstück aufgenommen bei 100 MHz mit Wasser als Koppelmedium (siehe Münze zum Vergleich). Die Helligkeit im Amplitudenkontrast entspricht der Amplitude des detektierten Ultraschallsignals (schwarz: kein Signal). Beim Phasenkontrast repräsentiert die Grauskala den vollen Phasenwinkel von 2p. Bei der hier verwendeten Frequenz entspricht das einmalige Durchlaufen des Bereichs der Grauskala (schwarz bis weiß) damit einer Laufzeitänderung von 10 ns (heller: schneller, dunkler: langsamer).

   Bei Proben mit planparallelen Oberflächen kann über die veränderliche Phasenlage der Ultraschallsignale die Änderung der Schallaufzeit und damit auch die Änderung der Schallgeschwindigkeit bestimmt werden. Über eine zusätzliche lokale Messung der Schallgeschwindigkeit kann der Verlauf der Schallgeschwindigkeit auch auf absoluten Skalen angegeben werden. An einer Probe mit gesinterten Titankugeln unterschiedlichen Durchmessers wird demonstriert, daß mit diesem Verfahren die Schallgeschwindigkeit ortsaufgelöst bestimmt werden kann (Abbildungen 10 und 11). Die Untersuchungen wurden in Kooperation mit K.-P. Wieters und M. Thieme, Institut für Werkstoffwissenschaft der Technischen Universität Dresden, durchgeführt. Die Arbeiten dienen dem Zweck, Werkstoffe für Knochenimplantate zu entwickeln, die bezüglich der mechanischen Eigenschaften dem natürlichen Knochen angepaßt sind.

PhaseAmplitude
Mittlere Kugeldurchmesser:
450 µm ... 210 µm ... 165 µm ... massiv
Abbildung 10:  Durchstrahlungsbilder einer scheibenförmigen Probe aus gesinterten Titankugeln mit unterschiedlichen Durchmessern und massivem Randbereich. Bildbreite 8 mm, Probendicke 2 mm; Frequenz 2 MHz.
Abbildung 11:  Aus den Ultraschallbildern in Abbildung 11 für eine Bildzeile (im oberen Drittel des Bildes) ermittelte Schallgeschwindigkeit und Dämpfung.

Referenzen

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26.3.1997, Martin Schubert