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Überblick

Forschungsprojekte / Research Projects

AG Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger

Entwicklung eines neuartigen zellulären Testsystems für G-Protein gekoppelte Rezeptoren
Development of novel cellular assay systems for G-protein coupled receptors

Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, Dipl. Pharm. M. Dinger

G-Protein gekoppelte Rezeptoren sind die Zielmoleküle einer Vielzahl von biologisch relevanter Substanzen, wie Neuropeptide und Hormone. Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung schneller Testsysteme in ganzen Zellen zur Aktivitätsbestimmung Gi und Gs-gekoppelter Rezeptoren. Solche Systeme ermöglichen die das rasche Untersuchen von neuen Liganden, die Analyse von Ligandbibliotheken aber auch die Identifizierung von für die Aktivierung wichtiger Rezeptorbereiche durch kombinatorische Mutagenese.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (Kommission für Technik und Innovation, Bern; Industrie Ausland)

Carrier-Peptide, die auf Calcitonin-Segmenten basieren
Calcitonin based peptide carriers

Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, Dipl. Pharm. U. Krauss

Die Aufnahme von Substanzen in Zellen mit Hilfe von Peptiden bietet eine völlig neue Methode des sogenannten Drug-Delivery, der Wirkstoffaufnahme. Calcitonin wird über die Nasenschleimhaut aufgenommen. Im Rahmen dieses Projektes sollen die molekularen Ursachen dieser Aufnahme analysiert werden. Mit Hilfe von Fragmenten wurde die relevante Sequenz identifiziert. Die Möglichkeiten des Einsatzes solcher Fragmente für die Aufnahme von Wirkstoffen, Proteinen und DNA in Zellen, sowie des transdermalen Transportes soll untersucht werden.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (TH-Projekt ETH Zürich, Kollaboration mit Prof. Merkle, ETH Zürich, Industrie Inland)

Die Rolle von NPY in der Epilepsie
On the role of neuropeptide Y in epilepsy

Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, Dr. D. Wissmann, Dipl. Pharm. J. Bader

Neuropeptid Y ist das am häufigsten vorkommende Neuropeptid im Gehirn. Insbesondere im Hippocampus kann es als endogener Schutzfaktor gegen epileptische Anfälle gesehen werden, da über den Y2-Rezeptor überschiessende Glutamatfreisetzung inhibiert wird. Im Rahmen des internationalen, interdisziplinären HFSP-Projektes sollen auf genetischer, neurophysiologischer, pharmakologischer und biochemischer Ebene die molekularen Grundlagen und die Rolle von NPY und seinen Rezeptoren in epileptischen Erkrankungen untersucht werden.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (Human Frontiers Science Project, Internationales Kooperationsprojekt mit Gruppen in USA, Canada, Italien, Österreich, Australien)

Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen von Neuropeptiden
Ligand-receptor interaction of neuropeptides

Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, Dipl. Pharm. R. Söll, Dipl. Pharm. M. Höfliger, Dipl. Pharm. J. Bader

Die molekularen Wechselwirkungen der Neuropeptide CGRP (Calcitonin-gene-related-peptide), Orexin und Neuropeptid Y an seine Rezeptoren sollen im Rahmen dieses Projektes untersucht werden. Hierfür werden konformativ eingeschränkte Analoga synthetisiert und diese auf ihre Aktivität an Neuroblastoma Zellen, die Rezeptoren endogen exprimieren und an rekombinant exprimierte Rezeptoren getestet. Ein Ziel ist die Entwicklung selektiver Liganden zur Identifizierung der Rolle einzelner Rezeptoren, da viele Liganden an mehrere Rezeptoren binden. Zudem sollen die Rezeptoren solubilisiert und die Bindung direkt durch Photoaffinitätsmarkierung identifiziert werden.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (Nationalfond Schweiz, DFG)

Dynamik G-Protein gekoppelter Rezeptoren: Interleukin- 8 und Neuropeptid Y
Dynamics of G-protein coupled receptors: interleukin-8 and neuropeptide Y

Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, Dipl. Chem. A. Bettio, Dipl. Biochem. Z. Machova, Dipl. Pharm. M. Dinger

Die Liganden Interleukin-8 (IL-8) und Neuropeptid Y (NPY) und Rezeptoren sollen mit biophysikalischen Sonden (Fluoreszenzlabel, Spinlabel, NMR-Label) ausgestattet werden. Dies kann auf chemischem (NPY) oder molekularbiologischem Wege (IL-8, Rezeptoren) durch Expression von GFP-Rezeptor-Fusionsproteinen oder chemischer Ligation erfolgen. Mit Hilfe von biophysikalischen Methoden sollen die Vorgänge: Annäherung der Liganden an die Membran und Bindung an den Rezeptor untersucht werden. Neben NMR, ESR-Methoden sollen Fluoreszenzmessungen und insbesondere FRET-Techniken (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Techniken) eingesetzt werden.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung

Die Rolle von Prohormonconvertase 1/3 in der Biosynthese von NPY
On the role of prohormone convertases in the processing of pro-NPY

Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, Dipl. Pharm. R.Pohl, Dipl. Biochem. Z. Machova

Neuropeptide werden in einem mehrstufigen Prozess von Nervenzellen gebildet. Häufig ist der erste Schritt die Spaltung eines Prohormons, welches dann weiter bis zum aktiven Peptid prozessiert wird. Im Rahmen des Projektes interessiert uns welche Rolle die Prohormaonconvertasen PC1/3 und PC2 bei der Biosynthese von NPY spielt. Hierfür werden markierte Analoga von pro-NPY dargestellt. Ziel ist die Entwicklung von Inhibitoren von Enzymen der PC-Superfamilie zur Blockierung der Freisetzung von NPY aus neuronalen Zellen.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (Schweizer Nationalfond)

Präklinische und klinische Evaluierung von Neuropeptide in der Tumortherapie
Preclinical and clinical evaluation of neuropeptides in tumor therapy

Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, Dipl. Pharm. M. Langer

Nach Bindung an ihren Rezeptor können Peptidhormone und ihre agonistisch wirksamen Analoga durch Rezeptorinternalisierung in die Zelle gelangen. Diesen Weg möchten wir uns zu Nütze machen um die Spezifität und Selektivität von Chemotherapeutika und Radiotherapeutika signifikant zu steigern und den therapeutischen Index zu verbessern. Hierfür werden Neuropeptide wie NPY und Bombesin mit Chemotherapeutka wie Daunorubicin oder Radiotherapeutika wie 99mTc konjugiert. An Tumorzelllinien kann Tumortoxizität und Selektivität untersucht werden, in Tiermodellen der therapeutische Index.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (Krebsliga Schweiz, Kooperation mit Prof. Schubiger, PSI Würenlingen, CH)

Strukturuntersuchungen von Loop-Bereichen G-Protein gekoppelter Rezeptoren
Structure elucidation of the loops of G-protein coupled receptors

Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, Dipl. Biol. Reto Bader

Mit Hilfe von NMR-Methoden soll die Struktur der extrazellulären Loops G-Protein gekoppelter Rezeptoren untersucht werden. Hierfür werden synthetische Loops dargestellt und diese durch helikale Membrananker versehen um die Transmembransegmente zu imitieren. Mit Hilfe von NMR-Untersuchungen soll sowohl die Struktur selbst, wie auch nach Ligandenzugabe untersucht werden. Bindungsrelevante und nichtrelevante Loops sollen verglichen werden und die Dynamik studiert werden.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (ETH Zürich, Kooperation mit Dr. O.Zerbe, ETH Zürich)

Nichtkonventionelle CN-Ligationskatalyse: Programmierung der Enzymspezifität durch Substratmimetika
Non-conventional CN-ligation catalysis: Programming of enzyme specificity by substrate mimetics

Dr. Frank Bordusa, Dipl. Biochem. N. Wehofsky, Dipl. Biol. K. Rall, Dipl. Med. Shaojun Xu

Im Focus des Projektes steht die Entwicklung neuer bioorganischer Syntheseansätze zur selektiven Ligation von CN-Bindungen. Da vorzugsweise Proteasen hierfür verwendet werden, diese aber in vivo bekanntermaßen keine CN-Bindungen knüpfen, sondern spalten, sind zur formalen Umkehrung ihrer Funktion Manipulationen notwendig. Im Mittelpunkt unseres Interesses stehen dabei die von uns neuentwickelten Substratmimetika in Kombination mit einem rationalen, Computer-gestützen Protein-Engineering. Auf diese Weise wurden bioorganische Strategien beispielsweise zur nativen Ligation von Peptiden, für selektive Modifizierung von Biopolymeren oder auch für die Darstellung organischer Carbonsäureamide entwickelt. Basierend auf der Aufklärung des zugrundeliegenden Katalysemechanismus konnten artifizielle Enzymvarianten mit deutlich besseren Syntheseeigenschaften erhalten werden, die derzeit als künstliche, in der Natur unbekannte "Peptidligasen" Ausgangspunkt für weitere Optimierungen sind.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung Drittmittel (DFG Innovationskolleg)

AG Prof. Dr. U. Hahn

Cytochrom P450-abhängige Alkan-Monooxygenase aus Acinetobacter calcoaceticus als Modellsystem zur Etablierung zellfreier Biotransformations-Systeme für die Hydroxylierung nichtsubstituierter Kohlenwasserstoffe:

Dr. O. Asperger, N. Gupta (Doktorand)

Mit der in der Arbeitsgruppe isolierten Hexadecanhydroxylase aus Acinetobacter calcoaceticus EB104, zusammengesetzt aus den löslichen Proteinen Ferredoxin, Ferredoxinreduktase und Cytochrom P450 werden Modelluntersuchungen zur Etablierung von Enzymreaktoren für die Biooxygenierung organischer Verbindungen durchgeführt. Mit dem Wildstamm wurden Kultivierungsverfahren im 10-Liter-Fermentor und entsprechende Präparationsverfahren im großem Maßstab entwickelt. Das Enzym oxidiert neben Alkanen auch Fettsäuren in terminaler Position Genetische Untersuchungen ergaben, dass die Gene der Systemproteine auf einem bislang unbekannten Plasmid lokalisiert sind.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (DFG: Graduiertenkolleg "Nichtkonventionelle Oxidationsreaktionen")

Proteindesign von Ribonuclease T1

Prof. Dr. U. Hahn, PD Dr. M. Grunow, Dr. H.-H. Förster, Dr. D. Haferburg, G. Kuhnle

Gentechnisch erzeugte Ribonuclease T1 und Varianten, bei denen einzelne oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht sind, werden enzymkinetisch auf ihre Stabilität und auf ihre Spaltungseigenschaften hin untersucht. Vornehmlich interessieren dabei auch die Aufklärung des Katalysemechanismus und die Hintergründe der hohen Substratspezifität.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (DFG: Proteindesign, Fonds der Chemischen Industrie)

Veränderung der Spezifität von Ribonuclease T1 mittels Zufallsmutagenese

Prof. Dr. U. Hahn, Dr. H.-H. Förster, Diplom-Biochemiker R. Czaja

Ribonuclease T1 (RNase T1) spaltet einzelsträngige RNA hochspezifisch nach Guanosin. Bemühungen, mit klassisch rationalem Ansatz die Spezifität dieses Enzyms mittels Protein-Design gentechnisch zu verändern, schlugen bisher fehl. Wir haben die Substraterkennungs-Region von RNase T1 per Zufallsmutagenese randomisiert und mittels bei uns entwickelter Indikatorplatten Varianten mit neuen Spezifitäten isoliert. Einige dieser Varianten konnten bereits kristallisiert und in Zusammenarbeit mit Prof. W. Saenger (FU Berlin) deren Röntgenstruktur ermittelt werden. Darüber hinaus werden in Zusammenarbeit mit Prof. Hofmann einige Varianten moleküldynamisch analysiert.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (DFG, Fonds der Chemischen Industrie)

Isolierung von Ribonuclease T1-Varianten mit veränderter Substratspezifität per Phage-Display und Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie in Lösung

Prof. Dr. U. Hahn, Dr. H.-H. Förster, Diplom-Biochemikerin K. Korn

Mit gentechnischen Methoden lassen sich Bakteriophagen herstellen, die auf ihrer Oberfläche Fremdproteine präsentieren (Phage-Display). Es ist uns gelungen, aktive Ribonuclease T1-präsentierende M13-Phagen zu konstruieren. Diese sollen innerhalb der sechs Aminosäuren umfassenden Substraterkennungsregion einer Zufallsmutagenese unterzogen werden. Mit Hilfe der Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie sollen dann in Zusammenarbeit mit Prof. R. Rigler (Karolinska Institut, Stockholm) in Lösung Varianten mit veränderter Spezifität detektiert werden (Ribonuclease T1 spaltet einzelsträngige RNA hochspezifisch nach Guanosin). Mit Hilfe geeigneter Expressionsvektoren kann das neu gewonnene Protein in größeren Mengen zwecks biochemischer Charakterisierung sowie Kristallisation produziert werden.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (DFG eingereicht, Fonds der Chemischen Industrie)

Klonierung und Strukturanalyse der Cytochrom P450-abhängigen Alkan-Mono-oxygenase aus Acinetobacter calcoaceticus - Ein Modellsystem für die enzymatische Hydroxylierung nichtsubstituierter Kohlenwasserstoffe

Prof. U. Hahn, PD Dr. O. Asperger, Dr. H.-H. Förster, Diplom-Biochemiker T. Meyer

Der Mechanismus der regioselektiven Kohlenwasserstoffhydroxylierung durch Alkan-Monooxygenasen ist für das theoretische Verständnis als auch für die Anwendung zur biokatalytischen Stoffwandlung von großem Interessen, aber durch Fehlen von Raumstrukturen solcher Enzyme wenig aufgeklärt. Durch Klonierung des Cytochroms P450 und der erforderlichen Systemkomponenten Ferredoxin und Ferredoxinreduktase aus Acinetobacter calcoaceticus werden Voraussetzungen für Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse dieser Proteine geschaffen. Aus Sequenzanalysen der Gene werden Struktur-Funktions-Beziehungen für Substrat- und Regioselektivitäten als auch Aussagen zu Wechselwirkungen zwischen den Proteinkomponenten abgeleitet

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (DFG: Graduiertenkolleg "Nichtkonventionelle Oxidationsreaktionen" )

Anreicherung von Aptameren per in vitro Selektion

Prof. Dr. U. Hahn, Dr. H.-H. Förster, Diplom-Biochemikerin H. Schürer, Diplom-Biochemiker T. Greiner-Stöffele, Dipl.-Biochem. M. Struhalla, Dipl.-Biochem. A. Hansen

Mittels der SELEX-Methode (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) wurden Aptamere angereichert werden, die spezifisch für das Antibiotikum Moenomycin sind. Aptamere zeichnen sich durch hohe Spezifität und Affinität gegenüber ihren Zielmolekülen aus, die Bindungskonstanten sind mit denen monoklonaler Antikörper vergleichbar. Besonders durch die geringen unspezifischen Wechselwirkungen mit verwandten Zielmolekülen und die schnelle Verfügbarkeit einmal selektierter Aptamere durch molekularbiologische Methoden könnten diese Oligonukleotide eine gute Ergänzung zu Antikörpern sein. Die selektierten Aptamere sollen dann detailliert charakterisiert und weiter optimiert werden.

Weiterführung: Ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (DFG Innovationskolleg INK 23, Chemisches Signal und Biologische Antwort , Fonds der Chemischen Industrie)

Arbeitsgruppe Biophysikalische Chemie

Sekundärstrukturbildung in Peptiden und ihre Beeinflussung durch nicht-proteinogene Aminosäuren

Prof. Dr. Hans-Jörg Hofmann (hofmann@rz.uni-leipzig.de), Dipl.-Biochem. Robert Günther

Im Zusammenhang mit der Entwicklung von Peptidanaloga und Peptidmimetica werden Untersuchungen zur Beeinflussung der Ausbildung von Sekundärstrukturen (Helices, Faltblätter, Turns) durch den Einbau nicht-proteinogener Aminosäuren mit Hilfe theoretischer Methoden (Quantenchemie, Molekülmechanik, Moleküldynamik) durchgeführt. Dabei stehen D-Aminosäuren, a,a-disubstituierte Aminosäuren, Dehydroaminosäuren, Azaaminosäuren, b-Aminosäuren und Hydrazinoaminosäuren im Vordergrund. Aus den Ergebnissen der Untersuchungen sollen Regeln für ein rationales Protein Design abgeleitet werden.
Weiterführung: nein
Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (DFG: Innovationskolleg "Chemisches Signal und biologische Antwort")

AG Prof. Dr. H.-P. Kleber

Bakterieller Stoffwechsel quaternärer Ammoniumverbindungen
Bacterial metabolism of quaternary ammonium compounds

Prof. Dr. H.-P. Kleber, Dr. T. Elßner

Neueste Studien haben gezeigt, dass die Umwandlung von Crotonobetain in L-Carnitin bei Escherichia coli auf CoA-Ebene abläuft und an der Reaktion zwei Enzyme - CaiB und CaiD - beteiligt sind. Diese Erkenntnis führte zur Aufstellung eines völlig neuen Mechanismus der Hydratisierung von Crotonobetain zu L-Carnitin. Dabei verfügt CaiB über eine CoA-Transferaseaktivität. CaiD ist in der Lage, Enoyl-CoA Verbindungen - z.B. Crotonobetainyl-CoA - zu hydratisieren. Die gebildeten Reaktionsprodukte in den von CaiB und CaiD katalysierten Reaktionen - insbesondere das L-Carnitinyl-CoA - konnten sowohl photometrisch als auch mit Hilfe der Massenspektrometrie (MALDI-TOF) nachgewiesen werden.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drittmittel (DFG)

Anwendung molekularbiologischer Diagnostik zum Screening und Monitoring von methanotrophen Bakterienstämmen für in situ Sanierungsverfahren
Application of molecular-biological diagnostics for screening and monitoring of methanotrophic bacteria for in situ remediation processes

Prof. Dr. H.-P. Kleber, Dipl.-Biol. Gerlind Rogge

Methanotrophe Bakterien wurden in einem in situ-Sanierungsversuch zur Biodegradation der im Grundwasser enthaltenen Schadstoffe (vorwiegend chlorierte Aromaten) eingesetzt. Während einer Versuchsdauer von 4 Monaten wurde mit mikrobiologischen und molekularbiologischen Methoden der applizierte Stamm Methylocystis sp. GB14 und die Aktivität seiner löslichen Methanmonooxygenase nachgewiesen. Zur Analyse der Struktur der komplexen bakteriellen Gemeinschaft wurden aus den Boden- und Wasserproben Bakterien isoliert, die in DGGE-Analysen mit der komplexen Boden-DNA zur Identifizierung der erhaltenen Fingerprints dienen sollen. Die Thematik wird unter dem Titel "Charakterisierung der Diversität, Struktur und Stabilität methanverwertender Mischkulturen mit molekularbiologischen Methoden an ausgewählten Applikationsvorhaben" weitergeführt.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Drittmittel (Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbH)

C/N-Spaltung des Carnitins durch ein Enzym aus Acinetobacter calcoaceticus
Splitting of the C-N bond in carnitine by an enzyme from Acinetobacter calcoaceticus

Prof. Dr. H.-P. Kleber, Dipl.-Lebensmittelchem. S. Strohschneider

Zur Ermittlung der Aktivität des Enzyms, welches die C/N-Bindung des Carnitins spaltet, wurde eine gaschromatographische Methode entwickelt, bei der die gebildete Menge des Produktes Trimethylamin (TMA) bestimmt wird. Es konnte gezeigt werden, dass die TMA-Abspaltung sauerstoffunabhängig ist und es sich bei dem Enzym um ein peripheres Membranprotein handelt, das leicht abgelöst werden kann. Die bisherige Anreicherung des Enzyms erfolgte - ausgehend von Membranfraktionen des Bakterienstammes - durch Behandlung mit NaCl, Ammoniumsulfatfällung und Chromatographie an Phenyl-Sepharose. Ziel der weiteren Untersuchungen ist es, das elektrophoretisch einheitliche C/N-spaltende Enzym in den wichtigsten molekularen und kinetischen Eigenschaften zu charakterisieren.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Haushaltfinanzierte Forschung und Drttmittel (DFG; Graduiertenkolleg "Nichtkonventionelle Oxidationsreaktionen")

Reinigung und Charakterisierung von Enzymen aus Proteus sp., die die Transformation von Crotonobetain zu L-Carnitin katalysieren
Purification and characterization of enzymes from Proteus sp., that catalyze the transformation of crotonobetaine into L-carnitine

Prof. Dr. H.-P. Kleber, Dipl.-Biochem. C. Engemann

Im Gegensatz zu E.. coli 044K74 ist Proteus sp. in der Lage, die Transformation von Crotonobetain zu L-Carnitin auch unter aeroben Bedingungen zu katalysieren. Für die Umwandlung von Crotonobetain zu L-Carnitin in Proteus sp. sind zwei, durch Crotonobetain bzw. L-Carnitin induzierbare Proteine, und g-Butyrobetainyl-CoA bzw. Crotonobetainyl-CoA als Cosubstrat notwendig. Die Enzyme konnten als Betainyl-CoA-Transferase und Enoyl-CoA-Hydratase charakterisiert und die Gene für beide Proteine identifiziert werden. Nach Klonierung dieser Gene wurden Überproduzenten für die beiden Proteine konstruiert. Darüber hinaus wurden in der Umgebung der beiden Gene weitere offene Leserahmen gefunden, die vermutlich ebenfalls Proteine codieren, die in den Carnitinmetabolismus von Proteus sp. involviert sind.

Weiterführung: ja

Finanzierung: Drittmittel (Industrie, Ausland)