Forschung
Tissue Engineering (TE) von Knochengewebe
Einleitung
Entwicklung von bioabbaubaren Zellträgern
Prozessentwicklung
Lipid Templating als Herstellungsmethode für 3-D hochpermeable Zellträger
Essentiell für die 3-D Zellkultur sind geeignete Zellträger, die eine gleichmäßige Besiedelung mit den Gewebe bildenden Zellen zu Beginn und ihre Versorgung mit Nährstoffen während der gesamten Kultivierungszeit erlauben. Diese Zellträger (Scaffolds) müssen über eine möglichst hohe Porosität verfügen, um den Zellen Platz zum Aufbau ihres Gewebes zu bieten. Darüber hinaus ist eine Voraussetzung für die Nährstoffversorgung des entstehenden Gewebes, dass die Porenräume in offenem Kontakt miteinander stehen (Permeabilität). Solche Zellträger bestehen z.B. aus nicht wasserlöslichen, bioabbaubaren Polymeren. In der Literatur ist eine Vielzahl von Herstellungsmethoden für Scaffolds beschrieben. Im einfachsten Fall werden Salzkristalle mit einer organischen Polymerlösung gemischt, das Lösungsmittel entzogen, so dass ein Blend aus dem festen Polymer und den Salzpartikeln entsteht. Nach Herauslösen des Salzes entsteht ein Scaffold, dessen Porosität sich durch den Salzgehalt des Blends einstellen lässt. Jedoch zeigen Scaffolds, die mit diesem Salt-Leaching Verfahren hergestellt wurden, häufig nicht ausreichende Interkonnektivität der Poren.
Zur Lösung des Problems der mangelnden Poreninterkonnektivität haben wir ein neues Verfahren entwickelt. Statt der Salzpartikel dienen uns Lipidmikropartikel als Porogen, die durch Schmelzdispersion und Siebfraktionierung in der gewünschten Größe hergestellt werden. Diese Lipidmikropartikel werden in einer organischen Lösung des bioabbaubaren Polymers dispergiert. Anschließend wird die Dispersion in eine Form extrudiert. In einem warmen n-Hexanbad wird durch Solvent Extraction das Polymer auf den schmelzenden und koaleszierenden Lipidpartikeln ausgefällt. Auf diese Weise ergeben sich interkonnektive Porenstrukturen, die eine gleichmäßige Besiedelung und verbesserte Nährstoffversorgung bewirken (Hacker, Tessmar et al., 2003). Die unten stehende Abbildung zeigt die Porenstrukturen von mit Salt leaching und Lipid Templating herstellten Scaffolds.
Reference List
Hacker,M., Tessmar,J., Neubauer,M., Blaimer,A., Blunk,T., Gopferich,A., Schulz,M.B., 2003. Towards biomimetic scaffolds: Anhydrous scaffold fabrication from biodegradable amine-reactive diblock copolymers. Biomaterials, 24, 4459-4473.
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| salt leaching hohe Porosität, geringe Permeabilität |
lipid templating hohe Permeabilität und Porosität |
| Elektronenmikroskopische Ausnahmen von Scaffolds, die mit verschiedenen Methoden hergestellt wurden. | |
Oberflächenmodifikation
Ein zentrales Problem im Bereich Biomaterialien ist die mangelnde Gewebeintegration von Zellträgern und Implantaten, die sich z.B. in der Bildung von Bindegewebsschichten im Kontakt mit Knochenersatzmaterialien äußert. Ein Ansatz zur Lösung dieses Problems ist die gezielte Modifikation von Biomaterialoberflächen, um Zell-Biomaterial-Interaktionen zu steuern. Die Adhäsion von Zellen an Biomaterialien erfolgt über Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen zwischen Integrinen oder durch ionische Wechselwirkungen mit Proteoglykanen der Zelloberfläche. Eine Strategie zur Kontrolle der Zell-Biomaterial-Wechselwirkungen ist daher die Oberflächenmodifikation mit möglichst Zell-Typ spezifischen Liganden der Integrine. Solche Liganden können auf dem Basispeptid RGD oder anderen Adhäsionspeptiden aufbauen, sollen mit bestimmten Integrinsubtypen möglichst spezifisch interagieren und so eine bevorzugte Adhäsion bestimmter Zellen bewirken. In unserem Kooperationsprojekt mit der Pharmazeutischen Technologie der Uni Regensburg und dem Forschungsverbund FORTEPRO werden Biomaterialien wie bioabbaubare Polymere und Hydroxylapatitoberflächen mit solchen Adhäsionspeptiden modifiziert, um eine möglichst selektive Adhäsion von mesenchymalen Stamm- und Progenitorzellen (MSC) aus Ratten (rMSC) und humanen Ursprungs zu erreichen (Schüssele, Volk et al., 2005).
Ein Problem bei der Gestaltung selektiver Oberflächen besteht jedoch in der Adsorption von Proteinen aus dem Blutplasma auf den Biomaterialien. Die adsorbierten Proteine vermitteln selbst die Adhäsion von Zellen, z.T. über ionische Wechselwirkungen mit Proteoglykanen oder über Rezeptor-Ligand-Interaktionen mit Integrinen. Die ungesteuerte Proteinadsorption auf Biomaterialien kann daher Oberflächenmodifikationen mit Adhäsionspeptiden leicht überdecken und unwirksam machen. Um dieses Problem zu vermindern, werden die Biomaterialien mit Polyethylenglykol modifiziert, um die Proteinadsorption auf der Oberfläche der Materialien zu reduzieren. Die gebundenen PEG-Ketten sollen dann mit Integrin spezifischen Adhäsionspeptiden modifiziert werden (Lieb, Hacker et al., 2005).
Modifikation von Polymeroberflächen
Mit dem Ziel, zelltypspezifische Materialien zu schaffen, wurden amino-reaktive Diblockcopolymere aus Polyethylenglykol und Polymilchsäure in der Arbeitsgruppe Göpferich entwickelt. In meiner Arbeitsgruppe wurde die Methode zur Herstellung von Scaffolds (s.o) auf diese Materialien abgestimmt. Durch die Vermeidung von Wasser in der Herstellung der Scaffolds konnten die reaktiven Polymere unter Erhaltung ihrer Reaktivität zu Scaffolds verarbeitet werden. Auf diese Weise konnten Scaffolds hergestellt werden, die beliebig mit aminogruppenhaltigen Molekülen modifiziert werden können. Die Modifikation erfordert eine Inkubation der Scaffolds in wässrigem Puffer, der die aminogruppenhaltigen Moleküle enthält. Anhand von Adhäsionspeptiden konnten wir die funktionelle Modifikation der Oberflächen zeigen. Die eingesetzten Adhäsionspeptide verfügen über eine hohe Affinität zum Integrin avb3/5, das von humanen Osteoblasten hochexprimiert wird. Humane Osteoblasten zeigten auf diesem Material hohe Adhäsion (Lieb, Hacker et al., 2005).
Modifikation von Keramikoberflächen
Im Rahmen des Kooperationsprojektes FORTEPRO wurden Hydroxylapatitkeramiken nach Silanisierung mit bifunktionellem PEG oberflächenmodifiziert. An die nach der Oberflächenmodifikation verbleibende Aldehydfunktion der PEG-Ketten wurden Modellpeptide wie Lysozym kovalent gebunden. Ziel ist es, Wachstumsfaktoren und Adhäsionspeptide an die reaktiven Oberflächen zu binden.
Suche nach geeigneten Integrintargets für eine selektive Adhäsion von mesenchymalen Stammzellen
Um die spezifische Adhäsion von MSC auf Peptid modifizierten Oberflächen zu erreichen, muss zunächst untersucht werden, welche Integrine sich auf MSC und speziell auf rMSC (Ratte) befinden. Geeignete Integrine wären solche, die auf konkurrierenden hämatopoietischen Zellen fehlen oder nur in geringen Ausmaß exprimiert werden. Um solche Integrine zu finden, wird mit Hilfe von Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) die Integrinzusammensetzung auf rMSC und hämatopoietischen Zellen in Kooperation mit dem LKH-Graz untersucht. Parallel wird der Effekt von hämatopoetischen Zellen auf die osteogene Differenzierung der MSC untersucht (s.Charakterisierung mesenchymaler Stammzellen).
Stimulation der Gewebebildung
Kultivierungsmethoden
Wachstumsfaktoren
Charakterisierung mesenchymaler Stammzellen aus der Ratte
Stammzellen und Knochenmark
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
MACS
Stimulation der Vaskularisierung
Entwicklung einer thermoreversibel gelierenden Gelmatrix
Controlled release von vascular endothelial growth factor (VEGF)
Angiogenesemodell
Reference List
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