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Forschung

Tissue Engineering (TE) von Knochengewebe

Einleitung

Entwicklung von bioabbaubaren Zellträgern

Prozessentwicklung

Oberflächenmodifikation

Stimulation der Gewebebildung

Kultivierungsmethoden

Wachstumsfaktoren

Charakterisierung mesenchymaler Stammzellen aus der Ratte

Stammzellen und Knochenmark

Das Knochenmark spielt eine zentrale Rolle im Entwicklungsprozess der hämatopoetischen und mesenchymalen Zellen. Im Knochenmark Erwachsener befinden sich undifferenzierte Zellen, sog. Stammzellen, die theoretisch über ein unbegrenztes Proliferationspotential verfügen und sich zu verschiedenen Zelltypen differenzieren lassen. Im Unterschied zu Stammzellen verfügen die aus der Stammzellteilung hervorgehenden Progenitorzellen nur über ein eingeschränktes Proliferations- und Differenzierungspotential. Stamm- und Progenitorzellen für hämatopoetische Zellen sind schon länger bekannt und daher besser untersucht als die kleinere Population der mesenchymalen Stamm-/ Progenitorzellen. Letztere interagieren im Knochenmark mit reifenden hämatopoetischen Zellen und lassen sich zu den verschiedenen Zelltypen des Bindegewebes differenzieren, wie z.B. Fibroblasten, Osteoblasten, Chondrozyten, Adipozyten und Myoblasten.

Mesenchymale Stammzellen können sich durch Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie cbfa-1 zu Osteoprogenitoren entwickeln. Diese Differenzierung kann durch Zugabe von Dexamethason oder Wachstumsfaktoren wie den Bone Morphogenic Proteins (BMPs) ausgelöst werden. Man unterscheidet verschiedene Phasen der Differenzierung. In der ersten Phase wird vor allem die hauptsächlich aus Kollagen I bestehende Extrazellulärmatrix gebildet. Gleichzeitig befinden sich die Zellen in einer Proliferationsphase. In der zweiten Phase kommt es zur Hochregulation von frühen Differenzierungsmarkern wie die Alkalische Phosphatase (ALP) und Matrixproteinen, wie Bone Sialoprotein und Osteonektin, die in die Mineralisierung der Matrix involviert sind. Reife Osteoblasten veranlassen den Einbau von Mineral in die gebildete Matrix und exprimieren den späten Knochenmarker Osteocalcin. Reife Osteoblasten differenzieren sich zu Osteocyten bzw. gehen in Apoptose. Im Unterschied zu Osteoblasten stammen die Matrix resorbierenden Osteoklasten aus der hämatopoetischen Linie.

Die Knochenmatrix wird von hoch aktiven Osteoblasten gebildet. Die Interaktionen mit der Matrix sind essentiell für die Funktion der Zellen. Osteoblasten interagieren über Integrine mit der sie umgebenden Matrix. Integrine sind transmembranäre Glycoproteine, die eine Verbindung zwischen dem Zytoplasma und der extrazellulären Matrix bilden. Sie verbinden die Matrix mit Proteinen des Zytoskeletts, wie z.B. Talin, Vinculin und Actin. Integrine sind heterodimere Rezeptoren, die aus zwei Einheiten bestehen, einer größeren alpha (120-180 kD) und einer kleineren beta (90-110 kD) Untereinheit. Durch Rezeptor-Ligand-Interaktionen und Clustering der Rezeptoren verändern sich die Aktivitäten mehrerer Rezeptor gekoppelter Kinasen (FAK, Fyn/Shc pathways), die Einfluss auf die Signaltransduktion und damit Funktion der Zelle und ihre Differenzierung nehmen können. Je nach Zusammensetzung des Integrins aus verschiedenen alpha- und beta-Untereinheiten existieren spezifische Liganden. Eine Reihe von Integrinen interagieren mit dem Tripeptid RGD (Arg-Gly-Asp), jedoch wird die spezifische Affinität zu einem Integrin durch benachbarte Aminosäuren und die räumlich Konfiguration des Peptids bestimmt, in der es als Bestandteil verschiedener Matrixproteine vorkommt.

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) ist eine durchflusszytometrische Analysenmethode, die die gleichzeitige Bestimmung verschiedener Zellparameter in einer Zellpopulation ermöglichlicht. Neben der Bestimmung der Größe einer Zelle werden Aussagen zur Granularität und der Präsenz von Oberflächenmarkern auf jeder einzelnen Zelle einer Population möglich. Zur Markierung von Oberflächenmarkern wie Integrinen werden die Zellen mit Fluoreszenz gekoppelten Antikörpern inkubiert, in einem laminaren Probenstrom einzeln an einem Laser vorbeigeleitet und aufgrund ihrer Lichtstreuung sowie ihre Fluoreszenz analysiert. Die gestreute und reflektierte Strahlung des Lasers sowie das von Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht lassen Aussagen über die Zellgröße (Vorwärtsstreulicht, FSC), die Granularität (Seitwärtsstreulicht, SSC) und die an der Zelloberfläche markierten Strukturen zu. Die eingesetzten Antikörper sind entweder direkt mit Fluorochromen, wie FITC (Fluorescein-Isothiocyanat), PE (Phycoerythrin), APC (Allophycocyanin) etc. gekoppelt oder mit einem Fluorochrom markierten Sekundärantikörper kombiniert. Theoretisch kann man gleichzeitig auf einer Zelle so viele Antigene bestimmen wie Fluoreszenzkanäle vorhanden sind.

MACS

Immunomagnetic Cell Sorting (MACS) ist eine Möglichkeit, Zellen anhand von exprimierten Oberflächenantigenen von anderen Zellen zu trennen. Dazu werden die Zielzellen mit Antikörpern markiert, die ihrerseits kleine magnetische Kügelchen tragen. Die markierten Zellen werden durch eine Säule gegeben, die sich in einem Magnetfeld befindet. Auf diese Weise werden die markierten Zellen in der Säule zurückgehalten, während die nicht markierten Zellen die Säule passieren. Um Hämatopoetische Zellen (HC) von MSC abzutrennen, werden HC mit einem Antikörper gegen CD45 (Common Leucocyte antigen) markiert und von den MSC abgetrennt.


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Stimulation der Vaskularisierung

Entwicklung einer thermoreversibel gelierenden Gelmatrix

Controlled release von vascular endothelial growth factor (VEGF)

Angiogenesemodell



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