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Entwicklung einer optischen Plattform zur Charakterisierung von (Oberflächen-) Bindungsreaktionen zwischen GAG- und Mediatormolekülen

Prof. Dr. Petra Schwille, Dr. Thomas Weidemann, Dr. Harekrushna Sahoo

Ziel des Projekts ist die Implementierung einer generischen biophysikalischen Strategie zur ultrasensitiven quantitativen Echtzeit-Analyse der Wechselwirkungen zwischen Glykosaminoglykanen (GAGs) bzw. deren Derivaten, und verschiedenen Mediatoren, in Lösung und an artifiziellen extrazellulären Matrizes, wie sie durch Verbundpartner entwickelt werden. Es soll eine grundlegende Hypothese getestet werden, nach der die extrazelluläre Matrix dafür verantwortlich ist, die Bindung der Mediatoren, wie Wachstumsfaktoren oder Morphogene, an ihre entsprechenden zellulären Rezeptoren insofern zu beeinflussen, als ihre schnelle Abdiffusion verhindert wird. In anderen Worten, die ECM hilft dabei, die Mediatoren länger in der Nähe der Zelloberfläche zu halten und erhöht dadurch die Wahrscheinlichkeit der Komplexbildung zwischen Mediatormolekül und Rezeptor. Für die Charakterisierung der Bindungsprozesse sollen verschiedene fluoreszenzbasierende Techniken zur Anwendung kommen, die eine exakte Analyse von Diffusions- und Bindungskinetiken in transparenten Medien auch bei extrem geringen Konzentrationen ermöglichen. Die Methode der Wahl ist dabei die ein- und mehrfarbige Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), die zusätzlich mit einer Totalreflexions (TIR)-Anregung und der flächigen Detektion durch eine CCD-Kamera etabliert werden soll. Mithilfe der FCS bzw. der TIR-FCS sollen zunächst Messungen beider Reaktionspartner in Lösung, in einem zweiten Schritt die Charakterisierung der Bindungskinetik von löslichen Mediatoren an oberflächenimmobilisierte GAG-Derivate, und in einem dritten Schritt auch die Bindung der Mediatoren an ihre Rezeptoren charakterisiert werden, wenn deren Membran von einer artifiziellen ECM überschichtet ist. Für die Messung der Rezeptor-Mediator-Interaktion werden verschiedene Strategien der aECM-Rekonstitution getestet. Einerseits sollen aECMs direkt an Zelloberflächen verankert werden, andererseits sollen artifizielle, unterstützte Membranen zum Einsatz kommen, in die Strukturproteine und Rezeptoren funktionell rekonstituiert werden sollen. Hierbei können wir auf bereits erfolgreich getestete Rekonstitutions-Protokolle zurückgreifen. Der Vergleich der Bindungsstudien Rezeptor-Mediator in An- und Abwesenheit einer aECM lässt direkte Schlüsse über deren funktionale Relevanz für die Bindungskinetik in vivo zu.

Abbildung: Überblick über die verschiedenen Messschemata. Zunächst sollen die Wechselwirkungen von GAGs mit Mediatoren in Lösung analysiert werden (Box oben), wobei FCS und FCCS zum Einsatz kommen sollen. In einer weiteren Stufe sollen die Diffusions- und Bindeeigenschaften von Mediatoren gemessen werden, die mit einer aECM konfrontiert sind, wobei letztere entweder auf festen Substraten, Zelloberflächen, oder auf artifiziellen Membranen mit rekonstituierten Strukturproteinen appliziert werden. Schließlich sollen Mediator-Rezeptor-Wechselwirkung in Zellen oder artifiziellen Membranen mit oder ohne aECM gemessen werden.
Die Detektion an den Oberflächen erfolgt mittels flächiger TIRF Anregung und FC(C)S-Detektion über eine EMCCD Kamera

Aktuelle Vorarbeiten

FCS/FCCS:

  1. Sahoo H, Schwille P. Influence of glycosaminoglycans on lipid dynamics in supported phospholipid bylayers. Soft Matter. 2013; in press.
  2. Sahoo H, Schwille P. FRET and FCS - Frieds or Foes? ChemPhysChem. 2011;12:532-41.
  3. García-Sáez AJ, Ries J, Orzáez M, Pérez-Payà E, Schwille P. Membrane promotes tBid interaction with Bcl-xL. Nat Struct Mol Biol. 2009;16:1178-85.
  4. Yu SR, Burkhardt M, Nowak M, Ries J, Petrášek Z, Scholpp S, Schwille P, Brand M. FGF8 morphogen gradient is formed by a source-sink mechanism with freely-diffusing molecules, Nature. 2009;461:533-6.
  5. Gärtner M, Mütze J, Ohrt T, Schwille P. Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy for precise concentration detection in vivo by background subtraction. Proc SPIE. 2009;7368:73681V.
  6. Ries J, Yu SR, Burkhardt M, Brand M, Schwille P. Modular scanning FCS quantifies receptor-ligand interactions in living multicellular organisms. Nature Methods. 2009;6:643-5.
  7. Ries J, Petrov  P, Schwille P. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy: effects of lateral diffusion and surface-generated fluorescence. Biophys J. 2008;95:390–9.
  8. Ries J, Schwille P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. PCCP. 2008;10:3487–97.
  9. Ries J, Ruckstuhl T, Verdes D, Schwille P. Supercritcal Angle Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophys J. 2008;94:221–9.
  10. Petrásek Z, Schwille P. Photobleaching in Two-Photon Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Chem Phys Chem. 2008;9:147–58.
  11. Bacia K, Schwille P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2007;2:2842–56.
  12. Kim SA, Heinze KG, Schwille P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 2007;4:963–73.
  13. Ries J, Schwille P. Studying slow membrane dynamics with continuous wave scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 2006;91:1915–24.
  14. Burkhardt M, Schwille P. Electron multiplying CCD based detection for spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy. Optics Express. 2006;14:5013–20.
  15. Bacia K, Kim SA, Schwille P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 2006;3:83–89.
  16. Burkhardt M, Heinze KG, Schwille P. Four-color fluorescence correlation spectroscopy realized in a grating-based detection platform. Opt Lett. 2005;30:2266–8.
  17. Kim SA, Heinze KG, Bacia K, Waxham MN & Schwille P. Two-photon cross-correlation analysis of intracellular reactions with variable stoichiometry. Biophys J. 2005;88:4319–36.
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Reconstituted Systems:

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  3. Trajkovic K, Hsu C, Chiantia S, Rajendran L, Wenzel D, Wieland F, Schwille P, Brügger B, Simons M. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science. 2008;319:1244–7.
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  5. Bacia K, Schuette CG, Kahya N, Jahn R, Schwille P. SNAREs prefer liquid-disordered over "raft" (liquid-ordered) domains when reconstituted into giant unilamellar vesicles. J Biol Chem. 2004;279:37951–5.